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脂质组学研究中的样品处理
前言
脂质是一类自然界存在的疏水或****、难溶于水而易溶于非极性溶剂的有机物小分子，存在于大多数生物体系中。脂质是细胞膜的骨架物质和第二能量来源，还参与细胞的许多重要功能，人类许多重大疾病都与脂质代谢紊乱有关，如糖尿病、肥胖病、癌症、阿兹海默症、以及一些传染病等，
作为代谢组学的重要分支之一，脂质组学(Lipidomics)的研究对象是生物体的所有脂质分子，并以此为依据推测其它与脂质作用的生物分子的变化，进而揭示脂质在各种生命活动中的重要作用机制。脂质组学是总体研究和这些疾病有关的脂质化合物，找到昭示这些疾病的生物标记物。
2005年国际上把组织、细胞中的脂质分子分为8大类(J Lipid Res 2009,50(Supp);9-14)，有明确结构的脂质化合物已经有38000个(BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 7):S9)，这8类脂质分子见表1。
表 1 8大类脂质分子
类别 | 缩写 | 数据库中的结构数量 |
脂肪酰类(Fatty acyls) | FA | 2678 |
甘油脂类(glycerolipids ) | GL | 3009 |
甘油磷酸脂类(glycerophospholipids) | GP | 1970 |
鞘脂类(sphingolipids ) | SP | 620 |
固醇脂类(sterol lipids ) | ST | 1744 |
异戊烯醇脂类(prenol lipids () | PR | 610 |
糖脂类(saccharolipids ) | SL | 11 |
多聚乙烯类(polyketides ) | PK | 132 |
在过去，由于技术限制人们难以分析数量巨大的脂质分析，因为多种脂质代谢产物的物理性质需要大批纯化系统、分离的复杂技术操作。2003年韩贤林等继基因组学、蛋白质组学等之后提出脂质组学(lipidomics)(Han X et a1.J Lipid Res，2003，44：1071)，脂质组学的发展推动了新分析平台的研发，特别是在质谱法领域，该方法已使这些操作合理化，并且已允许更多的脂质分子得到非常详细的分析。
脂质存在于细胞、细胞器和细胞外的体液如血浆、胆汁、乳、肠液、尿液中。若要研究某一特定部位的脂质，首先要将这部分组织或细胞分离出来。由于脂质不溶于水，通常采用有机溶剂进行萃取。传统的萃取剂是**仿、甲醇和水的混合液。所需的样品在这种混合液中提取所有脂质，向提取液中加入过量的水使之分成2个相，上面是甲醇和水，下面是**仿。脂质就留在**仿相，蒸发浓缩后，使之干燥就得到所需的脂质。这种脂质提取方法，能够提出组织样品中的总脂。这种方法降低了脂质的损失率，操作简便，而且提取效果较好。对于只检测总脂中的部分脂质，固相萃取(SPE)是一种较好的方法，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。固相萃取技术设备要求低，操作简单，能快速分离组分复杂及含量低的样品。当然由于化学分析样品前处理技术的发展，有许多其他可用的样品前处理方法。
总体上对脂质组学的研究Chin Chye Teo等归纳为如下的工作流程，第一步就是对样品的处理。
1、脂质组学研究的工作流程
根据Chin Chye Teo的综述报告(Chin Chye Teo et al,TrAC,2015,65:1-18)，脂质组学研究的工作流程如下表1.
表1 脂质组学研究的工作流程
从患者得到脂质组学研究的样品 | |
液体 | 固体 |
体液，泪水，血清，血浆，尿液 （低温保存样品） | 细胞，组织，器官 |
对上述样品进行萃取方法 | |
对极性化合物，单独的有机化合物进行： 液-液萃取，固相萃取 | 对能源性物质进行：加压液相萃取，微波辅助萃取，超声辅助萃取 |
萃取得到的脂质化合物 | |
使用色谱方法分离：气相色谱，液相色谱，电泳 | 不使用色谱方法分离：直接进样，成像 |
上述分离或未分离样品进行质谱分析 | |
质谱分析的接口 | 质量分析器 |
电子轰击电离（EI），电喷雾电离（ESI），化学电离（CI），大气压（APCI）化学与电离,基质辅助激光解析电离（MALDI） | 四级杆飞行时间质谱（qTOF）,三重四级杆质谱（ qqq）,轨道阱质谱（Orbitrap） |
质谱原始数据语预处理 （利用商品或自制软件） | |
分类和脂质鉴定（使用各种资源如LIPID maps,Lipid Bank,Lipid Blast） | |
判定在疾病中的机制/在疾病演化中的作用 | |
为进一步诊断找出生物标记物（预防），提供药物治疗的指导 | |
2、脂质组学的样品制备
本文只讲脂质组学的样品制备，Chin Chye Teo等总结了近年在脂质组学研究中使用的样品处理方法，见表2.
表2 脂质组学研究中的样品处理方法比较(Chin Chye Teo et al,TrAC,2015,65:1-18)
萃取方法 | 临床样品类型 （生物液体或固体） | 优点 | 缺点 | 原文文献编号 |
单一有机溶剂萃取（SOSE） | 血清（生物液体） 皮肤（固体） | 容易完成 萃取时间短 成本低 低温适于热敏感化合物 无需外部能量 | 使用有毒有机溶剂 分析时难以摆脱使用有机溶剂 | 1.2 3 |
液-液萃取（LLE） | 眼泪（生物液体） 血清（生物液体） 血浆（生物液体） 尿液（生物液体） 滑液（生物液体） 动脉粥样硬化血小板（生物液体） 皮肤（固体） 组织（固体） | 易于建立的方法 容易完成 设备便宜 萃取时间短 使用廉价溶剂（如甲醇，水） 低温适于热敏感化合物 无需外部能量 萃取时间短 | 使用大量有毒有机溶剂 常使用超过一种类型的溶剂 需要排除溶剂以免影响分析 | 2 4,9-13 5,14-22 8,23 7 24 25-27 28,29 |
固相萃取（SPE） | 血清（生物液体） 血清（生物液体） 血浆（生物液体） 眼（固体） 皮肤（固体） | 容易完成 清除干扰基体 EPE的选择 低温适于热敏感化合物 萃取时间短 | SPE萃取小柱比较贵 需要洗掉有机溶剂以免影响分析 使用有毒有机溶剂 分析时难以摆脱使用有机溶剂 | 1,12 2 30 26 3,27 |
固相微萃取（SPME） | 肺（固体） 头发（固体） | 容易完成 可与GC和GC xGC 联用 对挥发性化合物可以进行顶空气相色谱 有毒溶剂消耗量少 低温适于热敏感化合物 无需外部能量 萃取时间短 | 萃取头比较贵 需要洗掉有机溶剂以免影响分析 分析时难以摆脱使用有机溶剂 | 31 32 |
超临界流体萃取（SFE） | 血浆（生物液体） | 容易完成 萃取时间短 对非极性化合物萃取效率高 CO2可循环使用 温度压力可控 可加改性剂提高萃取液极性和效率 | 要精心操作 设备昂贵 | 33 |
微波辅助萃取（MAE） | 血浆（生物液体） 皮肤（固体） | 容易完成 萃取时间短 萃取效率高 萃取溶剂消耗量少 温度压力可控 | 需要冷却防止溶剂逃逸 购买设备费用高 | 34 35 |
超声辅助萃取（UAE） | 血（生物液体） | 容易完成 萃取时间短 萃取溶剂消耗量少 温度压力可控 | 听力会受损 要使用有毒有机溶剂 会吸入有害溶剂 需要外部能源 购买设备费用高 提高温度会使化合物降解 | 36,37 |
3、脂质组学的溶剂萃取
液-液萃取是脂质组学研究中使用最为普遍的方法，这一方法是使用两种互不混溶的有机溶剂——使用最多的是**仿、甲醇和水——为了对关键脂质类得到最大的萃取效率，从磷脂类和糖脂类到脂肪酸，三酰基甘油类(TAGs)、二酰基甘油类(DAGs)。最初使用的是Folch 脂质萃取法(**仿/甲醇/水为 8:4:3 v/v/v)，之后有Bligh 和 Dyer脂质萃取法(**仿/甲醇/水为 1:2:0.8 v/v/v)。
(1)Folch 脂质萃取法(Folch et al., J Biol Chem 1957, 226： 497)
把样品组织用2:1**仿/甲醇均一化，最后的溶剂体积是组织的20倍(20mL 溶剂里有1g样品)，分散均匀后于室温下把混合物在轨道振荡器上震动15-20min。均匀混合物经漏斗中折叠滤纸过滤，或进行离心处理，回收液相。
液相溶剂用0.2体积的水(20 mL液相使用4 mL水)，最好使用0.9%的NaCl溶液洗涤，涡旋几秒后在低速离心机(2000 rpm)上离心混合物，用虹吸方法弃去上层液相，用以分析神经节糖苷或小分子有机极性化合物，如需要(需移去标记分子)，用1:1甲醇/水洗涤交界处的有机相两次，无需混合全部制备物。
经离心分离后虹吸掉上面的液相，下面含有脂质的**仿在旋转蒸发器中真空蒸发，或用氮气吹拂到2-3 mL体积。
(2)Bligh 和 Dyer脂质萃取法(Can J Biochem Physiol 37:911-917)
a. 每1 mL 样品加入3.75mL 1:2(v/v) CHCl3:CH3OH 很好涡旋，如果要进行GC 分析，溶剂中要含有内标(如0.5μg谷甾醇)
b. 然后加入1.5mL CHCl3很好涡旋
c. 最后加入1.25mL蒸馏水很好涡旋
d. 在1000rpm离心机中室温下离心5min，得到一个两相分离(上层为水相，下层为有机相)的液体
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